Ini benar-benar merupakan masa keemasan untuk teknologi sequencing DNA. Dari alat sequencing-by-synthesis yang mulai populer di era dominasi Sanger hingga sequencing molekul tunggal dan nanopore, kini ada lebih banyak peluang daripada sebelumnya untuk menemukan sequencer yang tepat untuk setiap aplikasi.
Sekarang, ada teknologi sequencing baru yang sedang berkembang: sequencing by expansion (SBX). Dengan panjang pembacaan berkisar antara 50 bp hingga lebih dari 1.000 basa dan kecepatan pengurutan yang cepat yang memungkinkan analisis hampir secara real-time, SBX dapat menjadi pilihan yang tepat untuk laboratorium yang tertarik pada pengurutan genom lengkap somatik atau germinal atau aplikasi lainnya.
Pendekatan SBX yang unik menggabungkan kemajuan dalam metode nanopore sequencing dengan kimia baru yang menciptakan versi yang diperluas dari molekul asli untuk analisis yang lebih mudah dan akurat. Meskipun nanopore sequencing menawarkan sejumlah keunggulan, para pengembang telah lama menghadapi tantangan dalam mendeteksi sinyal dari setiap basa secara berurutan, yang tanpa secara tidak sengaja menangkap sinyal dari basa lain yang berada di dekatnya atau melewatkan basa karena molekul bergerak melalui nanopore terlalu cepat. Pendekatan SBX mengatasi masalah tersebut dengan memisahkan asam nukleat dari tulang punggung heliksnya dan memanfaatkan penanda baru, sambil mempertahankan urutan yang benar dan meningkatkan jarak di antara mereka untuk memungkinkan deteksi yang lebih akurat melalui nanopore.
Proses SBX dimulai dengan pembentukan molekul komplementer, diikuti oleh reaksi biokimia yang memperluas molekul tersebut menjadi polimer yang disebut Xpandomer. Molekul ini kemudian ditarik melalui pembaca nanopore untuk memungkinkan sequencing cepat molekul individu. Dengan jutaan nanopore yang tertanam dalam susunan sensor berdensitas tinggi, sequencing dapat dilakukan dalam skala besar — teknologi SBX dapat membaca ratusan juta basa per detik.
Membangun Xpandomer
Xpandomer dibuat dari proses konversi yang memperluas cetakan DNA asli, dengan mengkodekan urutannya menjadi polimer dengan jarak yang lebih besar di antara setiap basa. Xpandomer dibuat dari trifosfat nukleotida yang dapat diperluas, atau X-NTP. Terdapat empat X-NTP, yang masing-masing sesuai dengan setiap basa, dan telah direkayasa agar mudah dibedakan satu sama lain. X-NTP bertindak sebagai substrat selama proses replikasi yang mengubah templat asli menjadi Xpandomer. Proses yang didukung oleh polimerase yang disebut XP sintase ini telah terbukti menghasilkan akurasi pembacaan mentah yang sangat baik dan panjang pembacaan yang lebih panjang tanpa terhalang oleh kandungan GC. Xpandomer final memiliki panjang lebih dari 50 kali lipat dibandingkan templat DNA awal.
Membaca Sekuens
Setelah templat DNA diubah menjadi Xpandomer, templat tersebut siap untuk dimasukkan melalui nanopore biologis, di mana identitas dari setiap basa dapat dideteksi. Polimer tersebut diarahkan melalui pori-pori menggunakan pulsa listrik yang memindahkan molekul satu basa pada satu waktu. 
Gambar 1 (kiri): Struktur sekunder dari templat 222-mer sedang diurutkan. Struktur ini dihasilkan menggunakan alat prediksi struktur sekunder DNA di vectorbuilder.com
Gambar 2 (kanan): Area yang diperbesar dari jejak arus ion menunjukkan sekuensing SBX di wilayah homopolimer, pengulangan, dan hairpin. Diambil dari pracetak (lihat di bawah untuk informasi lebih lanjut).
Dengan jutaan pori-pori yang beroperasi secara bersamaan, teknologi SBX seharusnya memungkinkan pengguna untuk memulai pemanggilan basa bahkan saat polimer sedang dibaca dan menghentikan proses setelah persyaratan urutan terpenuhi. Pemrosesan data juga dapat dimulai saat proses berlangsung, sehingga memungkinkan peneliti untuk memulai analisis awal bahkan saat data urutan masih terus dikumpulkan. Berbeda dari sebagian besar sequencer yang memiliki waktu eksekusi tetap, waktu eksekusi SBX dapat disesuaikan untuk mendukung berbagai kebutuhan, seperti pemrosesan batch kecil atau optimasi untuk pembacaan yang lebih panjang.
Keunggulan SBX
Teknologi SBX dirancang dengan mempertimbangkan fleksibilitas dan kinerja. Teknologi ini menawarkan sejumlah keunggulan dibandingkan teknik sequencing lainnya yang ada saat ini, dan para ilmuwan terus berupaya untuk meningkatkan kinerjanya. Manfaat saat ini meliputi:
-
-
-
- Operasi fleksibel yang dapat disesuaikan dengan kebutuhan sampel
- Akurasi tinggi dengan skor F1 yang teruji sebesar >99,80% (SNV) dan >99,7% (indel) untuk sampel genom lengkap HG001.
- Kapasitas throughput yang sangat tinggi, dengan kemampuan untuk melakukan sequencing tujuh genom dalam 1 jam pada tingkat >30x; lebih dari 5 miliar pembacaan duplex dalam 1 jam sequencing.
- Panjang pembacaan yang fleksibel berkisar antara 50 bp hingga lebih dari 1000 bp.
- Opsi alur kerja ultra-cepat untuk sampel darurat, termasuk konversi sampel ke format panggilan varian dalam waktu kurang dari 7 jam.
- Efisiensi biaya yang diwujudkan melalui modul sensor yang ditingkatkan skalanya dan dapat digunakan kembali.
-
-
Pada saat penulisan ini, teknologi SBX masih dalam tahap pengembangan dan hanya akan digunakan untuk tujuan penelitian. Untuk perincian teknis lebih lanjut tentang teknologi SBX, dan juga hasil dari proyek percontohan sequncing, silakan lihat pracetak ini.
