เทคโนโลยีการหาลำดับเบสตัวใหม่แสดงศักยภาพในการวิเคราะห์ตัวอย่างที่รวดเร็ว ยืดหยุ่น และคุ้มค่า

เป็นยุคทองของเทคโนโลยีการหาลำดับดีเอ็นเออย่างแท้จริง ตั้งแต่เครื่องมือการหาลำดับเบสด้วยการสังเคราะห์ที่ได้รับความสนใจในยุคที่เทคนิค Sanger เป็นหลัก ไปจนถึงการหาลำดับเบสแบบโมเลกุลเดี่ยวและแบบนาโนพอร์ มีโอกาสมากกว่าที่เคยในการค้นหาเครื่องมือหาลำดับเบสที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานแต่ละประเภท

ขณะนี้มีเทคโนโลยีการหาลำดับเบสรูปแบบใหม่กำลังจะเกิดขึ้นคือ การหาลำดับเบสด้วยการขยาย (SBX) ด้วยความยาวของลำดับที่อ่านได้ตั้งแต่ 50 คู่เบสไปจนถึงมากกว่า 1,000 เบส และความเร็วในการหาลำดับเบสที่รวดเร็วซึ่งช่วยให้สามารถวิเคราะห์ได้เกือบจะเรียลไทม์ เทคโนโลยี SBX อาจเป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับห้องปฏิบัติการที่สนใจในการหาลำดับจีโนมทั้งหมดของเซลล์ร่างกายหรือเซลล์สืบพันธุ์ หรือการใช้งานอื่น ๆ

วิธีการเฉพาะตัวของ SBX ได้รวมความก้าวหน้าในวิธีการหาลำดับเบสแบบนาโนพอร์ เข้ากับเคมีใหม่ที่สร้างโมเลกุลต้นฉบับในรูปแบบขยายสำหรับการวิเคราะห์ที่ง่ายและแม่นยำยิ่งขึ้น ในขณะที่การหาลำดับเบสแบบนาโนพอร์มีข้อดีหลายประการ นักพัฒนาได้ประสบปัญหามานานกับความท้าทายในการตรวจจับสัญญาณจากเบสแต่ละตัวตามลำดับ โดยไม่บังเอิญรับสัญญาณจากเบสอื่น ๆ ที่อยู่ใกล้เคียง หรือพลาดเบสเนื่องจากโมเลกุลเคลื่อนที่ผ่านนาโนพอร์เร็วเกินไป วิธีการของ SBX เอาชนะปัญหานั้นได้โดยการแยกกรดนิวคลีอิกออกจากโครงสร้างเกลียวและใช้ประโยชน์จากสารรายงานชนิดใหม่ โดยรักษาลำดับที่ถูกต้องในขณะที่เพิ่มระยะห่างระหว่างพวกมัน เพื่อให้สามารถตรวจจับผ่านนาโนพอร์ได้อย่างแม่นยำยิ่งขึ้น

กระบวนการ SBX เริ่มต้นด้วยการสร้างโมเลกุลเสริม ตามด้วยปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่ขยายโมเลกุลให้เป็นพอลิเมอร์ที่เรียกว่า Xpandomer ซึ่งจากนั้นจะถูกดึงผ่านเครื่องอ่านนาโนพอร์ เพื่อให้สามารถหาลำดับเบสของโมเลกุลแต่ละตัวได้อย่างรวดเร็ว ด้วยนาโนพอร์หลายล้านช่องที่ฝังอยู่ในเซนเซอร์อาเรย์ที่มีความหนาแน่นสูง การหาลำดับเบสสามารถทำได้ในระดับใหญ่ เทคโนโลยี SBX สามารถอ่านเบสได้หลายร้อยล้านเบสต่อวินาที

การสร้าง Xpandomer

  Xpandomer ถูกสร้างขึ้นจากกระบวนการแปลงที่ขยายแม่แบบดีเอ็นเอต้นฉบับ โดยเข้ารหัสลำดับของมันให้เป็นพอลิเมอร์ที่มีระยะห่างระหว่างเบสแต่ละตัวมากขึ้น Xpandomer ถูกสร้างขึ้นจากนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟตที่ขยายได้ หรือ X-NTP ซึ่งมี X-NTP สี่ชนิด ซึ่งแต่ละชนิดตรงกับเบสหนึ่งตัว และถูกออกแบบทางวิศวกรรมให้สามารถแยกแยะออกจากกันได้ง่าย X-NTP ทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นในระหว่างกระบวนการจำลองแบบที่แปลงแม่แบบต้นฉบับให้เป็น Xpandomer กระบวนการนี้ซึ่งขับเคลื่อนด้วยพอลิเมอเรสที่เรียกว่า XP synthase ได้รับการแสดงให้เห็นว่าสามารถบรรลุความแม่นยำในการอ่านข้อมูลดิบที่ยอดเยี่ยมและความยาวในการอ่านที่ยาวขึ้น โดยไม่ถูกจำกัดด้วยปริมาณ GC Xpandomer สุดท้ายมีความยาวมากกว่า 50 เท่าของแม่แบบดีเอ็นเอเริ่มต้น

การอ่านลำดับ

เมื่อแม่แบบดีเอ็นเอถูกแปลงเป็น Xpandomer แล้ว ก็พร้อมที่จะถูกป้อนผ่านนาโนพอร์ทางชีวภาพ ซึ่งสามารถตรวจจับเอกลักษณ์ของเบสแต่ละตัวได้ พอลิเมอร์ถูกนำทางผ่านรูพรุนโดยใช้พัลส์ไฟฟ้าที่เคลื่อนย้ายโมเลกุลทีละเบส

รูปที่ 1 (ด้านซ้าย): โครงสร้างทุติยภูมิของแม่แบบขนาด 222 เมอร์ที่กำลังถูกหาลำดับเบส โครงสร้างนี้ถูกสร้างขึ้นผ่านเครื่องมือทำนายโครงสร้างทุติยภูมิของดีเอ็นเอบน vectorbuilder.com

รูปที่ 2 (ขวา): บริเวณที่ขยายของร่องรอยกระแสไอออนที่แสดงให้เห็นการหาลำดับเบสด้วย SBX ในบริเวณโฮโมพอลิเมอร์ ซ้ำ และแฮร์พิน นำมาจากเอกสารก่อนตีพิมพ์ (ดูด้านล่างสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม)

  ด้วยรูพรุนหลายล้านรูที่ทำงานพร้อมกัน เทคโนโลยี SBX ควรช่วยให้ผู้ใช้สามารถเริ่มต้นการระบุเบสในขณะที่พอลิเมอร์กำลังถูกอ่าน และหยุดการทำงานหลังจากที่ข้อกำหนดของลำดับเป็นที่พอใจแล้ว การประมวลผลข้อมูลยังสามารถเริ่มต้นได้ในระหว่างการทำงาน ทำให้ผู้วิจัยสามารถเริ่มการวิเคราะห์เบื้องต้นได้ แม้ในขณะที่ข้อมูลลำดับเบสยังคงถูกรวบรวม ซึ่งแตกต่างจากเครื่องมือหาลำดับเบสส่วนใหญ่ที่มีเวลาในการทำงานที่กำหนดไว้ เวลาในการทำงานของ SBX สามารถปรับเปลี่ยนได้เพื่อรองรับความต้องการที่หลากหลาย เช่น การทำมัลติเพล็กซ์สำหรับกลุ่มตัวอย่างขนาดเล็ก หรือการปรับให้เหมาะสมสำหรับการอ่านที่ยาวขึ้น

ข้อดีของ SBX

เทคโนโลยี SBX ได้รับการออกแบบโดยคำนึงถึงความยืดหยุ่นและประสิทธิภาพ นำเสนอข้อดีหลายประการเมื่อเทียบกับเทคนิคการหาลำดับเบสอื่น ๆ ในปัจจุบัน และนักวิทยาศาสตร์กำลังทำงานเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพต่อไป ประโยชน์ปัจจุบัน ได้แก่

• • • • การทำงานที่ยืดหยุ่นที่สามารถปรับให้เข้ากับความต้องการของตัวอย่างได้
      • ความแม่นยำสูงด้วยคะแนน F1 ที่แสดงถึง >99.80% (SNV) และ >99.7% (อินเดล) สำหรับ HG001 ตัวอย่างจีโนมทั้งหมด
      • ปริมาณงานสูงมาก ด้วยความสามารถที่จะลำดับเจ็ดจีโนมใน 1 ชั่วโมง ที่ >30x; >5B ดูเพล็กซ์อ่านใน 1 ชั่วโมงของการหาลำดับเบส
      • ความยาวอ่านที่ยืดหยุ่นซึ่งครอบคลุม 50bp ถึง >1000bp
      • ตัวเลือกขั้นตอนการทำงานที่รวดเร็วเป็นพิเศษสำหรับตัวอย่างเร่งด่วน รวมถึงตั้งแต่ตัวอย่างไปจนถึงรูปแบบการระบุความแปรผันในเวลา <7 ชั่วโมง
      • ประสิทธิภาพด้านต้นทุนที่ทำได้โดยโมดูลเซนเซอร์ที่ปรับขนาดและนำกลับมาใช้ใหม่ได้

  ในขณะที่เขียน เทคโนโลยี SBX ยังอยู่ในระหว่างการพัฒนาและจะใช้สำหรับการวิจัยเท่านั้น สำหรับรายละเอียดทางเทคนิคเพิ่มเติมเกี่ยวกับเทคโนโลยี SBX รวมถึงผลลัพธ์จากโครงการนำร่องการหาลำดับเบส โปรดอ้างอิงเอกสารก่อนตีพิมพ์ฉบับนี้