Это поистине золотой век технологий секвенирования ДНК. От технологий секвенирования по принципу «синтез-считывание», которые получили распространение в эпоху доминирования метода Сэнгера, до одномолекулярного и нанопорового секвенирования — сегодня как никогда много возможностей подобрать оптимальный секвенатор для каждой конкретной задачи.
Теперь на горизонте появился новый тип технологии секвенирования: секвенирование с расширением (SBX). С длиной считывания от 50 нуклеотидов до более 1 000 оснований и высокой скоростью секвенирования, обеспечивающей почти анализ в реальном времени, технология SBX может стать отличным решением для лабораторий, заинтересованных в соматическом или герминативном секвенировании всего генома, а также для других приложений.
Уникальный подход SBX объединяет достижения в области нанопорового секвенирования с новой химической технологией, позволяющей создавать «расширенную» версию исходной молекулы для более простого и точного анализа. Хотя нанопоровое секвенирование обладает рядом преимуществ, разработчики на протяжении долгого времени сталкиваются с трудностью точного считывания сигнала от каждого основания по порядку — без захвата сигналов от соседних близко расположенных оснований и без пропусков, возникающих из-за слишком быстрого прохождения молекулы через нанопору. Подход SBX решает эту проблему, отделяя нуклеиновые кислоты от их спирального остова и используя новые сигнальные метки. При этом сохраняется исходная последовательность, но расстояние между основаниями увеличивается, что обеспечивает более точное считывание сигнала при прохождении через нанопору.
Процесс SBX начинается с создания комплементарной молекулы, после чего запускается биохимическая реакция, расширяющая её в полимер, называемый экспандомер. Затем этот полимер пропускается через нанопоровый ридер, что позволяет быстро секвенировать отдельные молекулы. Благодаря миллионам нанопор, встроенных в высокоплотную сенсорную матрицу, секвенирование может выполняться в масштабах высокой пропускной способности — технология SBX способна считывать сотни миллионов оснований в секунду.
Создание экспандомера
Экспандомер формируется в результате процесса преобразования, при котором исходная матрица ДНК «расширяется»: ее последовательность кодируется в полимер с увеличенными расстояниями между отдельными основаниями. Экспандомеры построены из расширяемых нуклеотидных трифосфатов или X-NTP. Существует четыре типа X-NTP — по одному для каждого основания, — и они специально разработаны таким образом, чтобы их можно было легко различать между собой. X-NTP действуют как субстраты во время процесса репликации, который преобразует исходную матрицу в экспандомер. Катализируемый полимеразой под названием XP-синтазой, этот процесс продемонстрировал высокую точность «сырых» считываний и возможность получения более длинных прочтений без снижения эффективности при высоком содержании GC-пар. Конечный экспандомер более чем в 50 раз длиннее, чем исходная матрица ДНК.
Считывание последовательности
После преобразования матрицы ДНК в экспандомер она готова к пропусканию через биологическую нанопору, где может быть определена идентичность каждого основания. Полимер направляется через пору с помощью электрических импульсов, которые перемещают молекулу по одному основанию за раз. 
Рисунок 1 (слева): секвенирование вторичной структуры 222-мерной матрицы. Эта структура была создана с помощью инструмента прогнозирования вторичной структуры ДНК на vectorbuilder.com
Рисунок 2 (справа): увеличенные области ионных токовых дорожек, демонстрирующие секвенирование SBX гомополимерных, повторяющихся и шпилечных областей. Взято из препринта (подробнее см. ниже).
Благодаря одновременной работе миллионов пор технология SBX позволяет начинать распознавание оснований уже в процессе считывания полимера и завершать прогон сразу после достижения необходимых параметров по объему или глубине секвенирования. Обработка данных также может начаться во время цикла, позволяя исследователям начать ранний анализ, даже когда данные о последовательностях продолжают собираться. В отличие от большинства секвенаторов с фиксированной продолжительностью цикла, время работы SBX можно настраивать в зависимости от задач — будь то мультиплексирование небольших партий образцов или оптимизация для получения более длинных прочтений.
Преимущества SBX
Технология SBX была разработана с учетом гибкости и производительности. Она обладает рядом преимуществ по сравнению с другими современными методами секвенирования, и ученые работают над тем, чтобы продолжать улучшать ее эффективность. Текущие преимущества включают в себя:
-
-
-
- Гибкая работа, настраиваемая в соответствии с требованиями образца
- Высокая точность с продемонстрированными показателями F1 > 99,80 % для SNV и > 99,7 % для indel при секвенировании полного генома образцов HG001
- Очень высокая пропускная способность: возможность секвенирования семи геномов за 1 час при покрытии >30×; более 5 млрд дуплексных прочтений за 1 час секвенирования.
- Гибкая длина прочтений — от 50 п.н. до более 1000 п.н.
- Ультрабыстрые варианты рабочего процесса для срочных образцов — менее 7 часов от получения образца до формирования файла.
- Экономичность благодаря масштабируемому и многоразовому модулю датчиков
-
-
На момент подготовки настоящего доклада технология SBX все еще находится в стадии разработки и будет использоваться только в исследовательских целях. Более подробную техническую информацию о технологии SBX, а также результаты пилотного проекта секвенирования см. в данном препринте.
