지금은 DNA 염기 서열 분석 기술의 진정한 황금기입니다. 생어 분석법이 지배적이던 시기에 주목받기 시작한 sequencing-by-synthesis 도구부터 단일 분자 염기 서열 분석과 나노포어 염기 서열 분석에 이르기까지 각 적용 분야에 가장 적합한 염기 서열 분석 도구를 선택할 기회가 어느 때보다도 많아졌습니다.
이제 새로운 유형의 염기 서열 분석 기술이 부상하고 있습니다. 바로 확장 염기 서열 분석(Sequencing by Expansion, SBX)입니다. SBX는 약 50bp에서 1,000개가 넘는 염기에 이르는 판독 길이와 거의 실시간 분석이 가능할 정도의 빠른 염기 서열 분석 속도로 체세포 또는 생식 세포 전체 유전체 염기 서열 분석이나 기타 응용 분야에 관심이 있는 검사실에 적합한 선택지가 될 수 있습니다.
고유한 SBX 접근법은 나노포어 염기 서열 분석 방법의 발전과 새로운 화학적 방법을 결합하여 더 쉽고 정확하게 분석할 수 있도록 원래 분자의 확장된 형태를 생성하는 기술입니다. 나노포어 염기 서열 분석은 여러 이점을 제공하지만, 개발자들은 오랫동안 서로 가까이 있는 다른 염기의 신호를 함께 포착하지 않으면서 각 염기의 신호를 순서대로 검출하고, 분자가 나노포어를 너무 빠르게 통과해 염기를 놓치지 않도록 하는 데 어려움을 겪어 왔습니다. SBX 접근법은 핵산을 나선형 골격에서 분리하고 새로운 리포터를 활용하여 염기 서열의 순서는 그대로 유지하면서 염기들 사이의 거리를 늘려 나노포어를 통해 더 정확하게 검출할 수 있도록 함으로써 이러한 문제를 해결합니다.
SBX 프로세스는 먼저 상보적인 분자를 생성한 뒤 이를 Xpandomer라 불리는 중합체로 확장시키는 생화학적 반응을 거치며, 이렇게 만들어진 Xpandomer를 나노포어 판독기로 통과시켜 빠르게 단일 분자의 염기 서열을 분석합니다. 고밀도 센서 어레이에 수백만 개의 나노포어가 집적되어 있어 대량 염기 서열 분석이 가능합니다. SBX 기술로 초당 수억 개의 염기를 판독할 수 있습니다.
Xpandomer 만들기
Xpandomer는 원래의 DNA 템플릿을 확장하는 전환 과정을 통해 생성되며, 각 염기 사이의 거리가 더 넓은 중합체에 그 염기 서열이 인코딩됩니다. Xpandomer는 확장 가능한 뉴클레오티드 삼인산(X-NTP)으로부터 만들어집니다. X-NTP에는 네 종류가 있으며, 각각 하나의 염기에 대응하고 서로 쉽게 구별될 수 있도록 설계되었습니다. X-NTP는 원래의 템플릿을 Xpandomer로 전환하는 복제 과정에서 기질로 작용합니다. XP synthase라는 중합효소에 의해 촉매되는 이 과정은 GC 함량에 의해 방해받지 않으면서도 우수한 원시 판독 정확도와 더 긴 판독 길이를 달성하는 것으로 입증되었습니다. 최종적으로 생성된 Xpandomer는 초기 DNA 템플릿보다 길이가 50배 이상 길어집니다.
염기 서열 판독
DNA 템플릿이 Xpandomer로 전환되면 각 염기의 정체를 파악할 수 있도록 생물학적 나노포어를 통해 통과시킬 준비가 완료됩니다. 이 중합체는 분자를 한 번에 한 염기씩 이동시키는 전기 펄스를 사용해 나노포어를 통해 유도됩니다. 
그림 1(왼쪽): 염기 서열 분석 중인 222-mer 템플릿의 이차 구조. 이 구조는 vectorbuilder.com의 DNA 이차 구조 예측 도구를 사용하여 생성되었습니다.
그림 2(오른쪽): 동종중합체, 반복, 헤어핀 영역의 SBX 염기 서열 분석을 보여주는 이온 전류 추적의 확대 구간. 프리프린트 논문에서 발췌(자세한 내용은 아래 참고).
수백만 개의 포어가 동시에 작동하기 때문에, SBX 기술은 중합체가 판독되는 동안에도 사용자가 base calling을 시작하고 필요한 염기 서열 길이에 도달하면 실행을 중지할 수 있도록 설계되었습니다. 데이터 처리는 염기 서열 분석 실행과 동시에 시작할 수 있어 염기 서열 데이터가 계속 수집되는 동안 연구자가 초기 분석을 미리 진행할 수 있습니다. 실행 시간이 고정된 대부분의 염기 서열 분석 도구와 달리, SBX의 실행 시간은 소량 배치 멀티플렉싱이나 더 긴 길이 판독 최적화 등 다양한 요구 사항을 지원하도록 조정할 수 있습니다.
SBX의 장점
SBX 기술은 유연성과 성능을 염두에 두고 설계되었습니다. 현재 널리 사용되는 다른 염기 서열 분석 기술과 비교했을 때 여러 장점이 있으며, 과학자들은 그 성능을 계속 향상시키기 위해 연구를 이어가고 있습니다. 현재의 장점은 다음과 같습니다.
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- 검체 요구 사항에 맞게 조정 가능한 유연한 작동
- HG001 전체 유전체 검체를 기준으로 >99.80%(SNV), >99.7%(indel)의 F1 점수로 입증된 높은 정확도
- 1시간 동안 >30x로 7개 유전체의 염기 서열을 분석할 수 있고, 1시간 염기 서열 분석 시 >5B의 듀플렉스 판독이 가능한 매우 많은 처리량
- 50bp~>1,000bp 범위의 조정 가능한 판독 길이
- 긴급 검체를 위한 초고속 워크플로 옵션(검체 투입부터 변이 콜 포맷까지 7시간 미만)
- 확장 가능하고 재사용 가능한 센서 모듈로 비용 효율성 실현
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작성 시점을 기준으로 SBX 기술은 아직 개발 중이며 연구용으로만 사용될 예정입니다. SBX 기술에 대한 더 자세한 기술적 내용과 파일럿 염기 서열 분석 프로젝트의 결과는 이 프리프린트 논문을 참고하시기 바랍니다.
